2019年10月1日，5-羟甲基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在（zài）糖尿（niào）病（bìng）研究领域（yù）取得重要进展。2型糖尿病（bìng）（T2D）的血管并（bìng）发症是导（dǎo）致（zhì）2型糖尿病致残致死的重要病因（yīn），一直缺乏一种无创便（biàn）捷的（de）临床途径实现血管并（bìng）发（fā）症的发生发展（zhǎn）监测，达到早发现、早干预，以提高（gāo）T2D病人的整体生活质（zhì）量，减少卫（wèi）生经济负担（dān）。

该研究入组了62例2型糖尿病病人，采用5hmC-Seal技术对血浆cfDNA中表观遗传标志物5hmC的分布（bù）情况（kuàng）进行检测，分析5hmC标志（zhì）物与2型糖（táng）尿病（bìng）血管并发症发生（shēng）发展的相关性。结果表明（míng）5hmC标志物的变（biàn）化与（yǔ）T2D合并（bìng）大血（xuè）管/微（wēi）血管（guǎn）事件具有相关性，主要涉及（jí）一些与血（xuè）管生物学（xué）和糖尿病（包括胰岛素（sù）耐受（shòu）和炎症反应）相（xiàng）关（guān）的基因和信号通路。该研究建立的16个（gè）基（jī）因-5hmC标志（zhì）物（wù）组（zǔ）合检测（cè）可（kě）以准确（què）区（qū）分有并发症（zhèng）和无并发（fā）症的（de）2型糖尿病病人[实验组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优（yōu）于传（chuán）统临床变量例如白（bái）蛋（dàn）白（bái）尿。除此（cǐ）之外，还建（jiàn）立了13个基（jī）因-5hmC标志物组合（hé）检测，可以进一（yī）步（bù）区（qū）分T2D合并单（dān）一并（bìng）发症和多种（zhǒng）并发症（zhèng）[实验组（zǔ）：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明（míng）显优于其他传统临床变量。该研究得出（chū）结论，5hmC标志物反映了T2D病人大血管/微血管并发症发生过程中的（de）表（biǎo）观遗传变化（huà），因而5hmC-Seal检测技术在监测糖尿病血管并发症（zhèng）发（fā）生和进展方（fāng）面（miàn）具有良好的临床（chuáng）应用（yòng）前景。

本研究共纳入62例2型糖（táng）尿病病人（rén），包括（kuò）没有血管（guǎn）并发（fā）症的（de）病（bìng）人12例，有（yǒu）单一血管并发症的病（bìng）人34例（24例发生（shēng）大血管事（shì）件，10例发生微血管事件），以及（jí）有多种血管并发症的病（bìng）人16例。试验（yàn）收集62例病（bìng）人（rén）血浆，提取cfDNA，利用5hmC-Seal技术捕获（huò）外周血cfDNA中的5hmC序列，进（jìn）行二代测序，通（tōng）过（guò）生（shēng）物信息学（xué）分析找出（chū）并发症组与无并发症组（zǔ）之间（jiān）有显著5hmC修饰差异（yì）的基因（yīn），单（dān）一（yī）并发症组和多种（zhǒng）并（bìng）发（fā）症（zhèng）组之间有显著5hmC修饰差异的基因。随后利用回归模（mó）型（xíng）对差异基因进一步筛选、优化，弹（dàn）性网络（luò）进一（yī）步筛选，计（jì）算加权平均分（fèn），最后得到（dào）一（yī）组具有高度灵（líng）敏（mǐn）度和特异性的5hmC生物标记（jì）物，并进一（yī）步在（zài）实（shí）验组中验（yàn）证，分析（xī）其（qí）灵敏度和特（tè）异性（xìng）。并将新建（jiàn）立的5hmC标志物基因组合的检测性（xìng）能与传统临床（chuáng）变量进行对比分析。最后对相关基因进行了（le）信（xìn）号通路分（fèn）析和功能探究。

5hmC修饰水平与血管（guǎn）并发症（zhèng）具有相（xiàng）关性

利用逻辑回归（guī）模型对62例有（yǒu）并发症和无并发症2型糖尿病（bìng）病人的5hmC差异（yì）水平进行（háng）分析发现，有（yǒu）并发症2型糖尿病（bìng）病人（rén）的622个差异修饰候（hòu）选基因（包括上调和下调基（jī）因）的（de）归一化平（píng）均数（shù）要明（míng）显高于无并发症的（de）病人（P<0.001），但（dàn）是单一并发症和多发并发症病人之间没（méi）有显著（zhe）差异。

之后将有单一并发症（zhèng）或（huò）多种并（bìng）发（fā）症的（de）50例病（bìng）人用逻（luó）辑回归模（mó）型进行了对比，发（fā）现多种并发症的（de）病人的153个差（chà）异（yì）修饰候选基因（包括上调和下调基因）的归一化平（píng）均数要低于无并发（fā）症病（bìng）人（P<0.001）。

5hmC标志物可区（qū）分有（yǒu）无并发症（zhèng）患（huàn）者

62例2型糖尿病病人（rén）被随机分成训练组（n=31）和测试组（n=31）。利用弹性网（wǎng）络筛选后（hòu）发现，16基因-5hmC标志物组合检（jiǎn）测可以用于（yú）区分有并（bìng）发症和（hé）无并发症的2型糖尿病病人。

基于16基因组合模型 (Detection Model 1) 的加权平（píng）均分分析，发现无并发症病人（rén）的分（fèn）数在训（xùn）练（liàn）集和测（cè）试集中都（dōu）明显（xiǎn）低于有并发症的病（bìng）人。只考虑加权（quán）平均分（fèn）的话（huà），受试者工作特征曲线（xiàn）（ROC）分析表明将（jiāng）cutoff值设置成0.5时，在测试组中中（zhōng）的灵敏度为60%，特异性为100%。

5hmC标志物可区分病人是（shì）单一并发症还是多种并发症

50例有（yǒu）并发症（zhèng）的2型糖尿病病人被（bèi）随机分成训练（liàn）组（n=25）和（hé）测试组（n=25）。利用弹性（xìng）网（wǎng）络筛（shāi）选后发现，13基因-5hmC标（biāo）志物组合可（kě）以区分2型糖（táng）尿病病人是（shì）否发生单一并发症或多种并发（fā）症。

基于（yú）13基因（yīn）组（zǔ）合模型（xíng） (Detection Model 2)， 我们计算了单一并发症和多种（zhǒng）并发症的加权平均（jun1）分，发现在训练集和测试集中单一并发症和多种并发症病（bìng）人（rén）的分数都有明显（xiǎn）差异。值得一提（tí）的是，有（yǒu）肾病（bìng）并（bìng）发症和（hé）无肾病并发（fā）症病人的分数（shù）也有明显差异。利（lì）用加权平均分作为判断标准（zhǔn）的（de）受试者工（gōng）作特征曲线（ROC）表明，在（zài）测（cè）试组中当将cutoff值设成0.69时，灵敏度为（wéi）87.5%，特异性为68.8%。

5hmC标志物与传统临（lín）床（chuáng）变量/危险因子的对比（bǐ）

我们评估了不同临床变量（liàng）/危险（xiǎn）因子（zǐ）用（yòng）于监测血管（guǎn）并发症的灵敏度和（hé）特异性（见（jiàn）表1）。

信号通路分析和功能探究

有（yǒu）并发症（zhèng）和无并发症（zhèng）病（bìng）人（rén）的135个（gè）差异候选基因的功能注释分析（xī）表明，这些（xiē）基因主要（yào）富集在一些（xiē）经典的信号（hào）通路。错（cuò）误发现（xiàn）率相关P值位于前10%和基因数目≥3的（de）信号通路包括（kuò）由IGF1R, IL-10和（hé）FGFR2所（suǒ）介导（dǎo）的信号通路。由IGF1R和IL-10介导的（de）信（xìn）号通（tōng）路与胰岛素（sù）抵抗及（jí）炎症反应相关（guān），在（zài）血管生物学和糖尿病发生发（fā）展（zhǎn）过（guò）程中发挥重要（yào）作用。

Reactome相互作用网络的中心表明，泛素编码基因（yīn）[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛（fàn）素A-52亚基核糖体蛋（dàn）白融合产物1(UBA52)]是候选基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和（hé）TBCC）的重要连（lián）接者（zhě）。在（zài）这135个（gè）差异候（hòu）选基因中, 一（yī）些基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现（xiàn）出与糖尿病（bìng）病程相关的（de）倾向（xiàng），表明5hmC和糖尿病（bìng）血（xuè）管并发症之间（jiān）可能存在时间依（yī）赖性的相互作用。基于纵向（xiàng）时间队列的大样本研究，将可进一步明确5hmC变（biàn）化（huà）和（hé）糖（táng）尿病持续时（shí）间之间（jiān）的动态关联。关于单一并（bìng）发症（zhèng）和多种并发症病人的159个候选标志基（jī）因的（de）功能注释（shì）研究发现，存（cún）在（zài）细胞-细胞连接、胶原蛋（dàn）白形（xíng）成、新陈代（dài）谢、细胞应激应答（dá）信号通路的富集（jí），这些信号通路均与细胞基本功能密切相关（guān）。

血管（guǎn）并（bìng）发症是三分之二（èr）糖（táng）尿病病人的死（sǐ）亡原（yuán）因，若能（néng）及早有效（xiào）控制（zhì）血管并发症的发生（shēng），将极大地（dì）改善糖尿（niào）病（bìng）病人的生（shēng）存质量。该研究建（jiàn）立了一种利用（yòng）cfDNA进（jìn）行2型（xíng）糖尿病血管并发（fā）症监测的无（wú）创便捷方（fāng）法，较目（mù）前（qián）临床（chuáng）标志物（wù）能（néng）更准确地（dì）监控血（xuè）管并发症的发（fā）生（shēng），从而提示（shì）临床（chuáng）及早采取应对措施（shī），有效控制病情（qíng）进（jìn）展。